一．服務內容

我公司提供的單細胞建庫測序技術服務是針對大規(guī)模細胞群體進行表達譜分析，具體服務內容是利用10x Genomics微流控凝膠微珠技術對細胞懸液樣本中的500~10,000個單細胞進行捕獲標記，同時對每個標記了的細胞中的RNA分子進行獨立標記，建成用于illumina測序平臺的轉錄組測序文庫。建成的文庫將在illumina NGS測序平臺上進行測序。最終利用10x Genomics的Cell Ranger對測序的結果進行解碼，并針對單個細胞的表達譜差異對樣本細胞群進行細胞亞群分析。

二．實驗操作步驟概述

1. 對單細胞懸浮液樣本進行10x Genomics上機，制備油包水微滴乳濁液（GEMS）。

2. 油包水微滴乳濁液上PCR儀，進行逆轉錄操作。

3. 破乳后進行cDNA的回收、純化和擴增等操作。

4. 進行片段化，末端修復，加A、加接頭，Sample Index PCR等后續(xù)文庫構建操作。

三．實驗結果

我公司完成10x Genomics建庫技術服務的過程中提供2個結果，分別是文庫質檢結果報告和測序結果分析報告。

四．樣品要求及注意事項

1. 接收的樣品為單細胞懸液，如需組織解離，細胞分選等樣品制備需由客戶自行完成。

2. 單細胞懸液中，細胞間無粘連，無大于40uM的細胞碎片或其他顆粒物），單細胞懸液上樣前需過40uM細胞濾網（如Falcon cell strainer, REF 352340），確保不會堵塞微流控通道。

3. 細胞懸液中單細胞個數應大于預期實測細胞個數的2倍，如預期測到500個單細胞的數據，應提供至少1000個單細胞。

4. 細胞成活率應大于85%（用臺盼藍染色檢測）。

5. 上機單細胞懸液體積應小于30ul，建議細胞懸液濃度大約為1000個細胞/ul。

6. 如一次性上機多個樣品，第一個樣品制備完成到最后一個樣品制備完成時間相差不超過1個小時。

五．服務驗收標準

在細胞樣品達到上述要求的前提下，結果達到如下標準：

1.測序文庫合格：文庫檢測為單峰，且濃度高于3nM，體積大于25ul。

2.細胞捕獲效率達到50%：最終測序數據結果中的細胞數達到50%的起始細胞數。

六．服務承諾

1. 對于達到樣本要求的實驗，由于細胞計數誤差等實驗中存在的不確定性，實驗結果在上述標準的±20%以內都為可以接受的范圍。如果結果在驗收標準20%以下的（即捕獲效率低于40%）可判定實驗失敗，公司將承擔該樣本的試劑耗材及服務費等全部費用。

2. 如果實驗過程中確認試劑耗材質量的問題，我公司負責向10x Genomics廠家申請賠付。（通過其它渠道采購的試劑耗材，我們也將協(xié)助客戶完成索賠）

3. 如果細胞樣品未達到要求，客戶可以選擇重新送樣或風險上機，風險上機將不能按照上述標準驗收。

七．常見問題解答

1. 10x Genomics廠家的捕獲成功標準是65%，為什么貴公司承諾只有50%？

答：廠家測試捕獲效率用的是細胞系，細胞系樣品很容易制備成單細胞懸液，且能保證較高的細胞活性和完整性，而服務項目客戶很少用細胞系，大部分是用組織解離制備的細胞懸液，其細胞成活率相對較低，而且細胞計數的方法也會給結果造成一定偏差，因此我們把標準定在50%。

2. 建好的文庫送給測序公司上機前，文庫質檢達不到測序公司的合格標準怎么辦？

答：測序公司出于免責的考慮，對客戶自建的文庫質檢標準會比較嚴格，因此有可能我們庫檢沒問題的樣品測序公司會判定為不合格。請把測序公司的文庫質檢結果發(fā)送劉元和牛松，我們根據質檢結果判定是否應承擔測序上機風險。

3. 如果實驗失敗了，貴公司如何賠償？

答：兩種情況，一是如果因10x芯片或試劑導致實驗失敗，我們負責聯系廠家索賠，服務項目就更換試劑耗材重新做實驗。二是客戶細胞樣品合格、非風險上機情況下建庫失敗，就不收取費用。實驗過程中的問題，我們和客戶應本著互信原則協(xié)商解決，實驗失敗我們不對客戶細胞樣品進行賠償。

4. 除了利用10x Genomics的Cell Ranger進行的標準分析外，貴公司還能提供哪些分析？

答： 基本分析 

 ⑴ 提取測序序列 將bcl文件轉化為fastq，生成后期的樣本index序列文件，UMI序列及MRNA序列。

 ⑵ 序列比對注釋 將序列比對到相應的參考基因組的基因區(qū)域。

 ⑶ 按照細胞和基因組信息統(tǒng)計UMI，barcode信息，計算細胞和基因表達矩陣。

   其他高級分析

 ⑴ t-SNE降維分析及聚類：利用T分布隨機相鄰嵌入法(t-SNE)對數據降維處理，基于2維數據展示。利用聚類算法對細胞進行聚類分析，聚類后的細胞群體之間進行差異表達分析。

 ⑵ 基因的富集分析：差異基因進行后期的基因功能分析(GO和Pathway)。